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myTXTL® 蛋白质体外表达系统

蛋白质体外表达系统,数小时内表达出目标蛋白


产品概述

myTXTL® 是一种简单快速的蛋白质体外表达系统。基因的转录(Transcription, TX)和翻译(Translation, TL)基于大肠杆菌的内源的TXTL机制,在体外建立高效的无细胞反应体系。同时,又保证了T7表达系统的兼容性,为您的研究提供最大的灵活性。


myTXTL® 依赖于E. coli内源的转录和翻译机制,使用大肠杆菌RNA聚合酶与σ70因子。基因可以构建在P70启动子的下游。常用的原核表达载体,例如pGEX-4T-1含有Tac启动子,可直接用于myTXTL® Sigma 70 Master Mix。pET-28a(+)和pET-48b(+)含有T7启动子,仅仅需要添加P70a-T7rnap辅助质粒,用于表达T7 RNA聚合酶。


产品特点

快速 — 不需要转化、克隆筛选或者进行细胞裂解

高效率 — 目标蛋白在数小时内表达出来

高通量 — 一次实验可对多个样品进行操作

可靠 — 基于大肠杆菌提取物的蛋白表达系统

使用方便 — 仅需标准的实验室设备

即用型 — 即时即用的预混液,仅需将DNA加入表达系统

通用性 — 兼容T7表达系统


产品应用


蛋白表达


• 可溶蛋白和膜蛋白表达

• 蛋白质功能鉴定

• 高通量筛选

• 分子间互作分析

• 适用于难以表达蛋白质

• 体外蛋白质分子定向进化

合成生物学


• 噬菌体生产

• 基因调控网络构建

• 基础研究(比如,CRISPR系统鉴定)



产品系列


Sigma 70 Master Mix


基于E.coli的裂解液,Ready-to-Use预

混液,适用于微量反应体系(12 μL),

根据需求反应体系可适度增大。

GamS Nuclease Inhibitor


在myTXTL® Sigma 70预混液中添

加GamS,能有效提高线性DNA模

板的蛋白质产量。

Linear DNA Expression Kit


以线性DNA为模板的无细胞蛋白

质合成体系。具有高效表达可溶

蛋白和膜蛋白的能力,不需要添

加额外的稳定剂。



产品列表

Cat. No. DescriptionReactions
507024
myTXTL® Sigma 70 Master Mix Kit24
507096myTXTL® Sigma 70 Master Mix Kit96
501024GamS Nuclease Inhibitor Protein24
501096GamS Nuclease Inhibitor Protein96
508024myTXTL® Linear DNA Expression Kit 24
508096myTXTL® Linear DNA Expression Kit 96
说明书

实验流程

实验数据

FAQs

引用文献

相关产品


21.png


性能数据

11.jpg
12.jpg

Effect of plasmid concentration on in vitro protein production. deGFP expression is regulated by the interaction of the endogenous E. coli core RNA polymerase and the primary sigma factor 70 (σ70  )with the σ70 - specific promoter P70a .


Protein synthesis in myTXTL using the T7 expression system. deGFP expression under the control of the bacteriophage T7 promoter(PT7) is facilitated by initial expression of T7 RNA polymerase from anadditional plasmid.



来源于真核细胞的基因,如果没有针对大肠杆菌进行密码子优化,能否在myTXTL ® Sigma 70 Master Mix中进行蛋白表达?

myTXTL® Sigma 70 Master Mix 含有大肠杆菌缺乏的7种密码子,能够防止翻译的提前终止。


哪些种类的质粒适用于myTXTL ® Sigma 70 Master Mix?

myTXTL® 依赖于E. coli内源的转录和翻译机制,使用大肠杆菌RNA聚合酶与σ70因子。基因可以构建在P70启动子的下游。常用的原核表达载体,例如pGEX-4T-1含有Tac启动子,可直接用于myTXTL® Sigma 70 Master Mix。pET-28a(+)和pET-48b(+)含有T7启动子,仅仅需要添加P70a-T7rnap辅助质粒,用于表达T7 RNA聚合酶。


如果将 myTXTL® Sigma 70 Master  Mix 放在室温或4°C存放 ,还能继续用吗?

室温或4°C存放,会使 myTXTL® Sigma 70 Master  Mix的性能降低甚至丧失 。 为保证试剂盒始终具有最高的性能 , 一定要将Sigma 70 Master  Mix 存储在- 80°C,并且在使用结束后尽快保存 。


myTXTL® Sigma 70 Master Mix在反复冻融之后,蛋白质产率是否会降低?

我们建议尽可能将myTXTL® Sigma 70 Master Mix的冻融次数降到最低。我们的研究表明,反复冻融5次,不会影响 myTXTL® Sigma 70 Master Mix的蛋白产率。


myTXTL® Sigma 70 Master Mix对模板DNA有什么要求?

模板 DNA 的质量对于高效的蛋白质体外表达非常重要,模板DNA不能含有DNases、RNases和其它转录-翻译抑制剂(比如 ,EDTA、溴化乙锭、SDS、Cl-、乙醇)。

商业化的质粒提取试剂盒含有RNase,在质粒提取后可能无法完全去除。因此,我们强烈建议使用商业化的PCR纯化试剂盒,或者标准的氯仿抽提和乙醇洗涤彻底清除 RNase。模板DNA最好溶解在Nuclease-free水中。需要注意的是,引入Mg2+和K+可能会影响myTXTL® Sigma 70 Master Mix的性能,由于 Mg2+和K+对转录-翻译非常关键,所以已经在系统中进行了优化。


eGFP和deGFP有什么区别?

deGFP是eGFP在N-端和C-端的截短形式,deGFP更容易在无细胞系统中表达 。deGFP和eGFP的激发光谱、发射光谱以及荧光特性是相同的。


将myTXTL® Sigma 70 Master Mix溶解并离心后,在管子底部有一个小颗粒状物体,这是正常现象吗?

这是正常现象。在试剂盒生产过程中,可能会产生微小颗粒,这对反应没有影响。重要的是,在建立TXTL反应之前,一定要将Sigma 70 Master Mix彻底溶解、重悬并混匀。


由T7启动子控制的蛋白表达载体,能否在myTXTL® Sigma 70 Master Mix进行蛋白表达?

没有问题。只需要向反应体系中加入能够表达出T7 RNA聚合酶的质粒即可,比如,P70a-T7rnap。T7 RNA聚合酶的表达受到σ70-特异性启动子的调节。P70a-T7rnap和其它上百种质粒,可以从本公司的Toolbox 2.0 Plasmid Collection中购买。反应体系中P70a-T7rnap的最适浓度范围是0.1 nM-1 nM,浓度过高并不能增加蛋白产量。与P70a-T7rnap相比,T7启动子蛋白表达载体的浓度在反应体系中更加重要,我们推荐的浓度范围是5-20 nM。


myTXTL® Sigma 70 Master Mix是否适用于线性DNA模板?

虽然myTXTL® Sigma 70 Master Mix没有针对线性DNA模板进行优化,但是它同样适用于线性DNA模板。在反应体系中,添加本公司的核酸酶抑制剂GamS能够显著提高蛋白产量。


推荐使用哪种仪器设备进行myTXTL反应(恒温培养箱,恒温金属浴,水浴锅)?

由于myTXTL反应体系很小,只有12 μL,所以要避免反应体系中水分的蒸发,否则会提高myTXTL®体系中组分浓度并降低蛋白产量。一般来说,与空气相比,水具有更快的热传导速率,并且水浴锅不会产生剧烈的温度变化。所以水浴锅具有更稳定的恒温条件,能够保证更高的蛋白产率。


为什么在myTXTL®中,我无法使用正对照质粒P70a-deGFP表达出deGFP?

试剂盒保存不当。Sigma 70 Master Mix必须保存于-80°C,并且要避免反复冻融。

myTXTL反应体系中有核酸酶污染。为了避免核酸酶污染,在操作过程中,一定要戴手套,使用nuclease-free水、灭菌的枪头和灭菌的反应管。

请仔细阅读 myTXTL 产品手册中,推荐的myTXTL®反应体系。


我成功的表达出了正对照蛋白deGFP,但是我的蛋白却没有表达出来或者产率很低(使用的是质粒DNA模板),请问是否有改进的方法?

可以从以下影响蛋白产率的因素进行优化:

  • 基因表达框的构建(启动子强度,亲和纯化标签的位置,TXTL组分)

  • 质粒的纯度

  • 质粒的浓度

  • 孵育温度和时间

  • 蛋白折叠辅助因子,分子伴侣,氧化剂

另外,请参阅myTXTL产品手册中关于模板设计的建议。


如果我的蛋白没有活性,或者发生了沉淀,怎么办?

如果您的重组蛋白活性依赖于辅因子,比如金属离子或者辅酶,就需要将这些辅因子添加在反应体系中。另外,低剂量的温和去垢剂(Triton-X-100,十二烷基麦芽糖钠,CHAPS)可以作为分子伴侣,加入到反应体系中。请注意,myTXTL®不能对蛋白进行翻译后修饰,比如糖基化和磷酸化修饰。降低孵育温度也许可以阻止新生多肽链发生沉淀,并且促进蛋白的正确折叠。


myTXTL®能否促进二硫键的形成 ?

myTXTL® 不能促进蛋白形成二硫键。然而,有研究表明,在无细胞表达系统中,加入还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)混合物、二硫键异构酶C(DsbC)、蛋白质二硫键异构酶(PDI),以及/或者分子伴侣(比如DnaK,DnaJ,GroEL,GroES),能够促进二硫键的形成。另外,用碘乙酰胺(IAM)预处理反应体系,灭活细胞提取物中存在的内源性还原酶,也有可能会促进二硫键的形成(Review Article: Stech M & Kubick S, Antibodies 2015, 4, 12-33)


为什么使用不同批次的质粒DNA模板,得到的蛋白质产率是不一致的?

不同批次的质粒DNA模板中,含有的TXTL反应抑制剂浓度是不一致的,可能会导致蛋白质产率发生变化。请按照TXTL产品手册中推荐的方法,进行质粒DNA模板的制备。


当孵育结束后,我可以将myTXTL® 反应液冻存起来吗?

样品的后续处理过程和储存形式主要由您感兴趣的蛋白质、DNA或RNA分子的稳定性来决定,并且进行评估和优化。但是为了保证样品的完整性,我们建议孵育结束后立刻进行后续实验,或者将样品保存于≤ -20°C。


当TXTL反应结束后,如何分析我的蛋白产率和质量?

除了使用标准的生化方法,比如考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和western blot,无细胞蛋白表达系统最大的优势是开放的系统环境,允许对目的蛋白直接进行定量和活性测定,或者进行亲和纯化(如果带有亲和标签)。如果使用SDS-PAGE分析,您可以直接从反应液中取1-3 µL进行电泳。为了减少背景信号,可以使用TCA-丙酮或者乙酸铵-甲醇沉淀目标蛋白


对deGFP/eGFP进行定量时,对读板仪的设置有哪些建议?

最重要的设置是,激发波长和发射波长必须符合deGFP/eGFP的荧光特性(激发波长λEx 488 nm,发射波长λEm 535 nm)。如果要考虑酶标板之间的荧光重现性,还需要设置读取模式,积分时间,增益值等


myTXTL® Sigma 70 Master Mix Kit和myTXTL® Linear DNA Kit的区别是什么?

myTXTL® Sigma 70 Master Mix Kit以myTXTL® Linear DNA Kit为基础,具有高效表达可溶蛋白和膜蛋白的能力,不需要添加额外的稳定剂。只需要将线性 DNA 模板加入优化的预混液中即可进行蛋白的表达。


myTXTL® Linear DNA Kit是否适用于环状DNA模板?

是的,myTXTL® Linear DNA Expression Kit允许使用线性和环状DNA模板。

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